Agarose gel electrophoresis Southern Blot & Hybridization

Hybridization เป็นเทคนิคที่อาศัยคุณสมบัติเรื่องการจับคู่เบสอย่างจำเพาะของ ดี เอ็น เอ ( G:C, A:T) พันธะไฮโดรเจนที่เชื่อมระหว่างคู่เบสถูกทำลายได้ง่าย ๆ ด้วยความร้อน หรือการเพิ่ม pH ของสารละลาย 

 

เมื่อพันธะไฮโดรเจนถูกทำลาย ดี เอ็น เอ จะคลายเกลียว เปลี่ยนสภาพโมเลกุลจาก ดี เอ็น เอ รูปร่างเกลียวคู่เป็น ดี เอ็น เอ เส้นเดี่ยว เรียกว่าเกิด denaturation ของ ดี เอ็น เอ เมื่อลดอุณหภูมิ หรือลด pH ของสารละลาย ดี เอ็น เอ ลงสู่สภาพเดิม สาย ดี เอ็น เอ จะกลับมาเข้าคู่กันใหม่ โดยอาศัยการจับคู่เบสอย่างจำเพาะ

ก่อนที่จะเรียนลึกไปในเรื่อง hybridization นักศึกษาควรมาทำความรู้จักกับ DNA probe กันก่อน DNA probe คือ ดี เอ็น เอ สายสั้น ๆ ซึ่งติดฉลากกัมมันตรังสีไว้ DNA probe มีคุณสมบัติที่สำคัญคือ ความสามารถจับกับชิ้น ดี เอ็น เอ ที่สนใจได้อย่างจำเพาะ ทำให้เราสามารถติดตามชิ้น ดี เอ็น เอ ที่สนใจนั้นได้โดยอาศัยกัมมันตภาพรังสีที่ติดอยู่กับ DNA probe

Southern Blot Hybridization
เมื่อแยกชิ้น ดี เอ็น เอ ที่มีขนาดต่างกันออกจากกันด้วย agarose gel electrophoresis แล้ว หากต้องการทำhybridization เพื่อตรวจหาว่า ดี เอ็น เอ ชิ้นที่มียีนที่ต้องการศึกษาอยู่ในตำแหน่ง

ใดของ electrogram เราจำเป็นที่จะต้องย้าย ดี เอ็น เอ ที่แยกแล้วนั้นออกจาก agaroes gel ไปสู่แผ่น nitrocellulose ซึ่งมีความคงทนมากกว่า ทั้งนี้เพราะว่าระหว่างการ hybridization จะต้องมีการเพิ่มอุณหภูมิเพื่อให้ ดี เอ็น เอ แยกสาย ก่อนที่จะจับคู่เบสใหม่กับ DNA probe ความร้อนที่ใช้นี้สามารถทำลาย agaroes gel ให้หลอมละลายหายไปได้

การเคลื่อนย้ายชิ้น ดี เอ็น เอ จาก agarose gel ไปสู่แผ่น nitrocellulose ทำโดยการวางแผ่น nitrocellulose ไว้บน agarose gel ที่แช่สารละลายบัฟเฟอร์อยู่ แล้ววางกระดาษซับหลาย ๆ ชั้นบนแผ่น nitrocellulose อีกทีหนึ่ง แผ่นกระดาษซับที่แห้งจะดูดซับสารละลายบัฟเฟอร์ที่อยู่ข้างล่างให้เคลื่อนที่ขึ้น ชะผ่าน agarose gel และแผ่น nitrocellulose สู่กระดาษซับ ในขณะที่เคลื่อนที่ สารละลายบัฟเฟอร์จะชะเอาชิ้น ดี เอ็น เอ ให้หลุดออกจาก agarose gel

ไปเกาะติดกับแผ่น nitrocellulose ไปด้วย โดยวิธีนี้เราจึงสามารถย้ายชิ้น ดี เอ็น เอ จาก agarose gel ไปสู่ nitrocellulose ได้ วิธีการนี้เรียกว่า southern blot และถ้านำ DNA probe มาจับกับชิ้น ดี เอ็น เอ ที่ย้ายมาอยู่บน nitrocellulose อย่างจำเพาะ ต่ออีกทีหนึ่ง วิธีการทั้งหมดที่ประกอบด้วย agarose gel electrophoresis, southern blot และ hybridization จะเรียกว่า southern blot hybridization
เรียบเรียงโดย ผศ.นพ.ธีรวรรธน์
ขันทอง …http://www.student.chula.ac.th/~49371019/hybridization.htm

Leave a Reply

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out / Change )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out / Change )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out / Change )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Log Out / Change )

Connecting to %s